2023年值得关注的创新药前沿技术TOP20

前沿技术的发展是医学进步的重要基石。近年来，细胞疗法、偶联药物、双抗/多抗、基因疗法/基因编辑疗法/碱基编辑疗法、蛋白降解、核酸药物、AI制药等前沿技术成为了创新药研发领域的热门赛道，由这些前沿技术衍生而来的已上市药物为癌症、传染性疾病、遗传性疾病等疾病的治疗带来了新的变革。

在刚刚过去的2022年，多个前沿技术赛道涌现出具有临床转化潜力的新技术，本文结合医药魔方NextPharma数据库-转化医学模块，筛选出2023年值得关注的20项创新药前沿技术，供大家参考。

细胞疗法

1、MASTER

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01245-x

成果：2022年3月24日，北卡罗来纳州立大学和北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员在 Nature Biotechnology上发表研究，报道他们开发出了一种用于T 细胞修饰和释放的多功能藻酸盐支架（Multifunctional Alginate Scaffold for T Cell Engineering and Release, MASTER）皮下植入物，能够在体内快速生产和释放CAR-T细胞，并将制造时间缩短到1天。小鼠淋巴瘤异种移植模型研究显示：体内产生的CAR-T细胞进入血液循环并控制远端肿瘤生长，展现出比传统CAR-T更强的持久性。

MASTER是一种生物相容的海绵状材料，使用FDA批准的非免疫原性材料，外观和手感都像迷你棉花糖。治疗时，研究人员先从患者体内分离出T细胞，并将这些初始（未激活）的T细胞与工程病毒混合。然后将这种混合物倒在MASTER上。MASTER由激活T细胞的抗体修饰，吸收混合物后，细胞激活过程几乎立即开始。与此同时，MASTER通过手术植入目标体内。

植入后，细胞激活过程继续进行。随着T细胞被激活，它们开始对修饰过的病毒产生反应，这些病毒将它们重新编程为CAR-T细胞。MASTER材料中还含有可以促进细胞增殖的白介素。植入后，这些白介素开始渗出，促进CAR-T细胞的快速增殖。（推荐阅读：比传统CAR-T更快更有效更便宜！MASTER值得期待 | Nature子刊）

2、ILTCK

杂志：Nature

论文：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04632-1

成果：2022年4月20日，发表在Nature杂志上的一篇论文中，美国纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究人员称，他们发现了一种新型免疫细胞“士兵”——类先天性杀伤型T细胞（Killer Innate-like T cell，ILTCK）。这种新型细胞长时间激活后不会耗竭，具有强大的肿瘤组织驻留能力，极具抗肿瘤潜力。

肿瘤新抗原是指由肿瘤细胞基因突变引起的能被免疫系统识别并激活免疫系统的异常蛋白。大量的免疫检查点药物依赖CD8+T细胞识别肿瘤新抗原发挥肿瘤杀伤作用。然而，在此过程中，肿瘤细胞通过上调免疫检查点抑制T细胞活性，甚至诱导T细胞耗竭。

与肿瘤新抗原相对性的概念是非突变抗原，也即肿瘤相关抗原，是肿瘤细胞中优先或异常表达的自身抗原，在正常细胞中也可能有一定程度的表达。ILTCK识别的对象就是非突变抗原，且识别过程不依赖树突状细胞的抗原提呈作用，因此，ILTCK的这种特性更像先天性淋巴细胞，始终处于战备状态，时刻准备进攻。

正常条件下，识别非突变抗原的T细胞都会被机体清除，避免产生自身免疫疾病。然而，ILTCK并不攻击正常组织。一方面，ILTCK识别非突变抗原后，TCR信号传导被抑制，ILTCK无法激活。另一方面，ILTCK发挥功能需要IL-15参与。IL-15在肿瘤组织高表达，而在正常组织中表达量很少。因此，ILTCK可以特异性清除肿瘤细胞。（推荐阅读：Nature重磅：实体瘤克星来了！ILTCK有望发挥更强肿瘤杀伤作用）

3、SNIP CAR-T

杂志：Cell

论文：http://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.041 

成果：2022年4月27日，来自美国斯坦福大学的Crystal Mackall教授团队在Cell上发表文章，报道了一种名为SNIP的高性能药物可调节系统，可利用FDA批准的小分子来调节CAR-T活性。实验证明SNIP CAR-T细胞平台提供了可靠的安全开关，降低了CAR-T细胞的on-target off-tumor毒性，并且没有“泄露”活性，同时其在多种原位实体瘤模型中的疗效均优于组成型（constitutive）CAR-T细胞平台。

来源：Cell

这项研究中主要突破点在于开发了一种安全可控的CAR结构，与其他已报道的可调节CAR结构相比，该研究使用了蛋白酶水解的新调控模式，能够在“开”与“关”之间具有更宽的活性调控区间，在“关”的模式下泄露更小，在“开”的模式下功能更强。该研究也证明，使用这种开关制备的CAR-T，表现出更强的体内抗肿瘤效果。而原因可能与CAR-T在开启之前，保持的‘resting’状态有关。（推荐阅读：钱程教授点评 | Cell里程碑：CAR-T安全开关——SNIP，突破实体瘤限制）

4、Quikin CAR-T

杂志：Nature

论文：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04632-1

成果：2022年8月31日，来自华东师范大学生命科学学院张楫钦、刘明耀、杜冰、李大力团队与浙江大学医学院附属第一医院黄河、胡永仙团队以及邦耀生物研究人员合作在Nature上发文，首次报道了一种创新性非病毒定点整合CAR-T技术（Quikin CART®）的开发，及其治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤（r/r NHL）的积极临床试验结果（NCT04213469）。

Quikin CART®可以在不使用病毒载体的情况下，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，通过一步电转完成CAR序列在T细胞基因组特定位点（PD-1）的精确插入，有效解决了目前CAR-T技术的病毒使用和随机整合这两个问题。并且，同时实现CAR稳定表达和PD-1基因敲除（研究证明阻断PD-1/PD-L1通路可提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性），可谓一箭双雕。

研究者发起的临床试验（IIT）结果显示，该团队制备的靶向CD19非病毒PD-1定点整合CAR-T细胞（PD1-19bbz）治疗r/r B-NHL 患者，未观察到CAR-T治疗相关的神经毒性和2级以上的细胞因子风暴。完全缓解率（CR）达87.5%，客观缓解率（ORR）为100%，其中有5例患者响应时间超过1年。（推荐阅读：刘明耀访谈 | 中国CAR-T技术首登Nature，究竟给行业带来怎样的突破？）

蛋白降解剂

5、AUTOTAC

杂志：Nature Communications

论文：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29845-w

成果：2022年4月12日，来自韩国的一个科学家团队在Nature Communications上发表的一篇论文提出了AUTOTAC技术。

自噬货物受体p62/SQSTM1在多泛素化货物和自噬小体之间起桥梁作用。多泛素化的货物与p62的UBA结构域结合，导致p62构象变化。这种构象的改变暴露了p62的LIR基序，并促进其与LC3在自噬膜上的相互作用。

AUTOTAC分子由一个与p62的ZZ域相互作用的模块和一个靶蛋白（protein of interest，POI）靶向模块组成。AUTOTAC的作用是连接POI和p62，不依赖于POI的泛素化。AUTOTAC促进p62的寡聚和活化，导致POI通过自噬-溶酶体途径降解。AUTOTAC不仅能介导单体蛋白的靶向降解，还能介导有聚集倾向的蛋白的降解。利用表达人类病理tau突变体的小鼠模型，研究者们证明AUTOTAC能够有效地去除错误折叠的tau。相比之下，以蛋白酶体为基础的技术，如PROTAC和分子胶，在处理错误折叠的蛋白质方面通常是无效的。除Tau外，AUTOTAC还能有效去除多种癌蛋白，如降解雄激素受体(AR)。

开发AUTOTAC技术的代表性公司是AUTOTACBio，总部位于韩国首尔。公司CEO Yong Tae Kwon博士是上述论文的共同通讯作者。目前，该公司布局了神经退行性疾病（如AD）、癌症、代谢综合征、肌肉萎缩症等多种疾病领域，且已经搭建了丰富的管线。（推荐阅读：蛋白降解剂「图鉴」：PROTAC、LYTAC、ATAC、AbTAC、AUTAC、ATTEC……12大技术，引领下一轮新药研发浪潮）

6、NanoTAC

杂志：Nature Communications

论文：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29670-1

成果：降解剂介导的靶蛋白（protein of interest，POI）下调为探索尚未成药的蛋白质组提供了机会。相比传统的PROTAC技术，标签靶向蛋白降解剂（tag-Targeted Protein Degrader，tTPD）有着独特的作用机制，已成为蛋白降解领域备受关注的潜力工具，有望通过更改标签大大扩大可降解蛋白的范围。

2022年4月19日，来自墨尔本大学医学生物学系的研究团队开发了一种具有催化活性的蛋白降解剂NanoLuc靶向PROTAC（NanoLuc-targeting PROTACs，NanoTACs），可以通过“劫持”CRBN复合物降解NanoLuc荧光素酶标签底物，进一步扩充了tTPD工具箱。

三种tTPD结构图（来源：Nature Communications）

研究团队通过慢病毒转导技术在HEK293T细胞中稳定表达了一种tTPD通用报告蛋白Halo-EGFP/Firefly-NanoLuc-FKBPF36V，可以同时对比NanoTACs、dTAGs与HaloPROTACs的降解能力。其中，dTAGs通过识别FKBP12F36V而不是靶蛋白来发挥降解作用，HaloPROTACs通过识别HaloTag7调节靶蛋白丰度。新开发的NanoLuc分子量为19 kDa，是一种可以生物发光的蛋白质标签，稳定性好、体积小，具有良好的生物相容性。NanoTACs是将NanoLuc抑制剂与E3连接酶配体结合，利用复合物触发NanoLuc标记的靶蛋白降解。相对于蛋白印迹实验（Western blot，WB）信号输出，生物发光信号的灵敏度更好，可以更敏锐地捕捉蛋白水平变化。

三种tTPD技术优缺点对比（来源：NatureCommunications）

这三种tTPD技术都具有可逆降解POI的前景，方法均具有良好的特异性。然而，每种技术都有各自的优缺点，研究人员需要根据应用场景选择合适的POI标签。（推荐阅读：新型蛋白降解技术NanoTAC 来了！与PROTAC相比，有何不同？）

7、PROTAB

杂志：Nature

论文：https://doi.org/10.1038/s41586-022-05235-6

成果：以PROTAC为代表的蛋白降解技术相对于单纯的靶标抑制具有额外的优势。然而，设计可以同时结合2个大体积蛋白质导致PROTAC分子结构复杂，口服生物利用度低。2022年9月22日，来自基因泰克的科学家开发了一种蛋白水解靶向抗体（PROTAB）技术。PROTAB是一种抗体分子，可以同时结合细胞膜E3连接酶和跨膜蛋白，从而诱导靶蛋白在体内外降解。这项研究提出了一种可实现快速开发具有生物活性的细胞表面蛋白降解剂的策略，相关研究发表在Nature杂志上。

胰岛素样生长因子1受体（IGF1R）是一种受体赖氨酸激酶，在多种组织和肿瘤中介导生长因子信号转导。RNF43和ZNRF3是两种细胞膜E3连接酶。作为概念验证，研究人员首先开发了靶向IGF1R的PROTAB。研究人员设计的PROTAB是一种双抗，结构一端靶向IGF1R，另一端靶向RNF43或ZNRF3的N端糖蛋白D（gD）。将该PROTAB加入表达融合gD的RNF43或ZNRF3细胞中，细胞表面的IGF1R被有效降解，而没有表达这种E3连接酶的细胞不受影响。研究进一步评估了PROTAB技术的通用性，靶向膜相关蛋白HER2和PD-L1开发的PROTAB导致细胞中靶蛋白显著降解。这些结果证明了PROTAB技术可有效降解多种热门细胞表面靶点，未来潜力巨大。

靶向IGF1R的PROTAB结构示意图（来源：Nature）

总结而言，这项技术可以依赖细胞膜E3连接酶广泛降解跨膜受体，基于不同的连接酶可实现组织特异性的靶标降解。尽管PROTAB技术发挥所有的治疗潜力还有赖进一步研究确定，这项技术与模块化抗体工程技术向结合，将为基础研究与药物发现做出更大贡献。（推荐阅读：Nature：PROTAC之后，PROTAB来了）

8、KineTAC

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01456-2

成果：由于PROTAC和分子胶类降解剂需要E3连接酶和蛋白酶体的参与，此类药物只能降解细胞内的靶蛋白。然而，绝大多数可成药靶标位于细胞表面或细胞外，研发人员对开发细胞膜外蛋白降解剂的兴趣愈发浓厚。尽管一些科学家团队已经开发出了降解细胞外蛋白的降解剂，但多种技术都只能诱导细胞膜表面的靶蛋白降解，而对细胞外的可溶性蛋白靶标无能为力。

2022年9月22日，Katarina Pance等人在Nature Biotechnology杂志上发表了最新研究成果，报道了一种利用诱饵受体CXCR7将细胞膜及细胞外靶蛋白运送至溶酶体降解的新型降解剂，即细胞因子受体靶向嵌合体（cytokine receptor-targeting chimera，KineTACs）技术。这种KineTAC是一种多功能和模块化的靶向降解平台，可降解各类细胞的细胞表面和细胞外可溶性蛋白。

KineTAC降解细胞膜蛋白作用机理（来源：Nature Biotechnology）

KineTAC是一类基于人支架蛋白构造的完全重组的双抗，利用内源性细胞因子介导的同源受体内化，诱导细胞表面和细胞外靶蛋白经溶酶体降解。研究人员利用趋化因子CXCL12作为概念验证。CXCL12可以与诱饵受体CXCR7结合后内化。因此，KineTAC一端为趋化因子CXCL12，另一端结合靶蛋白，复合物进入溶酶体后靶蛋白被降解。

接下来，研究人员尝试利用这种技术降解细胞外可溶性蛋白。VEGF和TNF-α是两种对肿瘤治疗意义重大的细胞外可溶性蛋白。研究人员利用FDA批准的VEGF抑制剂bevacizumab开发的KineTAC分子CXCL12–Beva有效介导HeLa细胞模型中VEGF的细胞内吞和降解；而利用adalimumab开发的CXCL12–Ada也有效介导了TNF-α的降解。因此，KineTAC对细胞外可溶性蛋白同样有效（推荐阅读：KineTAC来了，降解细胞外蛋白有戏 | Nature子刊）

蛋白稳定剂

9、DUBTAC

杂志：Nature Chemical Biology

论文：https://doi.org/10.1038/s41589-022-00971-2

成果：异常的蛋白降解是一些疾病的致病机制，如囊性纤维化（CF）和某些类型的癌症。对于这些疾病，需要想办法开发“靶向蛋白稳定剂（Targeted Protein Stabilization，TPS），而不是靶向蛋白降解剂。

2022年2月24日，来自加州大学伯克利分校的科学家们在发表于Nature Chemical Biology 上的一篇论文中描述了一种结构类似PROTAC、能够实现靶向蛋白稳定的异双功能分子——去泛素酶靶向嵌合体(deubiquitinase-targeting chimeras，DUBTACs)。研究证明，使用DUBTAC能够稳定和恢复不稳定的突变形式的氯离子通道蛋白CFTR的功能。

DUBTAC是哑铃形状的分子,由结合致病蛋白的化合物通过linker连接一个去泛素酶（DUB）的招募配体组成。DUB能够去除被降解蛋白的泛素链，防止其被破坏，从而稳定蛋白质水平。（来源：Nature Chemical Biology）

科学家们合成了一个名为NJH-2-057的DUBTAC。NJH-2-057由EN523、lumacaftor以及C5烷基链组成。CFTR的移码突变(ΔF508)是导致CF最常见的原因。ΔF508-CFTR不稳定，会经历K48多聚泛素化然后被降解，从而导致氯离子穿过上皮细胞膜的运输中断。NJH-2-057结构中，EN523可以和能够拉近DUB和ΔF508-CFTR的距离，从而导致ΔF508-CFTR的去泛素化和随之而来的稳定。

领导该研究的Daniel Nomura教授说：“我们相信，这种新型DUBTAC治疗平台能够通过靶向先前被认为不可靶向的异常降解致病蛋白，开发出对抗多种人类疾病的新药物，包括癌症、神经退行性疾病以及多种遗传性疾病。”

值得一提的是，目前已经有公司专注于靶向蛋白稳定剂（TPS）的开发。2021年6月，TPS领域的先驱生物技术公司Stablix Therapeutics完成了6300万美元的A轮融资，该公司目前的开发重点是罕见病、癌症以及免疫性疾病。（推荐阅读：PROTAC之后，DUBTAC来了！）

AI制药

10、ProteinMPNN

杂志：Science

论文：https://doi.org/10.1126/science.add2187;

https://doi.org/10.1126/science.add1964

成果：2022年9月15日，华盛顿大学的生物化学家David Baker团队在Science上连发两篇论文，表示他们创造的新方法ProteinMPNN，可以在几秒钟内而不是几个月内设计出蛋白质；另外，使用一种叫作“幻觉”（Hallucinating）的方法可以生成广泛的对称蛋白质同源寡聚体。表明机器学习可用于比以前更准确、更快速地创建蛋白质分子。斯德哥尔摩大学的计算生物学家Arne Elofsson认为，像ProteinMPNN这样的深度学习工具已经改变了蛋白质设计的游戏规则。（推荐阅读：比AlphaFold更强？1天2篇Science，这个团队的新技术几秒钟生成全新蛋白质）

11、RGN2

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01432-w

成果：2021年，两种深度学习方法AlphaFold2和RoseTTAFold的重大突破，使蛋白质结构预测领域持续数10年的研究达到了顶峰，这两种方法几乎与蛋白质结构测定的实验方法一样准确。但是这两种算法都消耗了大量的计算资源，而且因为它们依赖于多个序列比对作为输入，所以在预测孤儿蛋白（orphan protein，指具有很少或没有同源性的蛋白质）的结构方面效果不佳。

2022年10月3日，加州大学旧金山分校的Chowdhury团队在Nature Biotechnology发表文章，称他们在预测孤儿蛋白方面取得了实质性的进展，他们的递归几何网络2（RGN2）方法依赖于蛋白质语言算法，计算时间比AlphaFold2和RoseTTAFold少106倍，且在预测孤儿蛋白的结构方面平均优于AlphaFold2和RoseTTAFold，这些结果突出了该领域的惊人步伐。（推荐阅读：击败AlphaFold2！RGN2带来蛋白结构预测新突破）

碱基编辑

12、CLUSTER

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-021-01105-0

成果：RNA碱基编辑是一种很有前途的基因组编辑替代方案。目前的RNA编辑方法利用了一种内源性RNA编辑酶-作用于RNA的腺苷脱氨酶(adenosine deaminases acting on RNA, ADARs)，同时需要一段向导RNA（guide RNAs, gRNAs）来引导ADARs到达目标并在那里进行所需的编辑，但这种方法存在效率低下、旁观者编辑等问题。

2022年1月3日，图宾根大学和斯坦福大学的研究人员在Nature Biotechnology发表论文，介绍了计算机优化的CLUSTER gRNAs，它们以多价方式结合其靶信使RNA，实现高精度和高效率的编辑，并能够靶向使用以前的gRNAs设计无法获得的序列。

CLUSTER gRNAs可以使用病毒进行基因编码和递送，并且在广泛的细胞系中具有活性。在细胞培养中，CLUSTER gRNAs实现了内源性转录本的靶向编辑，编辑效率高达45%，无旁观者编辑。在体内，通过流体动力学尾静脉注射递送到小鼠肝脏的CLUSTER gRNAs达到了10%的编辑效率。总结来说，CLUSTER方法为RNA碱基编辑领域的药物开发开辟了途径。

13、LEAPER 2.0

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-021-01180-3

成果：2019年，北京大学魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志报导了新型RNA编辑技术LEAPER。与以CRISPR为基础的DNA或者RNA编辑技术不同，LEAPER仅需要在细胞中表达特殊设计的RNA（ADAR-recruiting RNA, arRNA）即可招募细胞中内源脱氨酶ADARs，实现靶向目标RNA中腺苷A→肌苷I（鸟苷G）的编辑。由于无需引入外源编辑酶或效应蛋白，避免了由此引起的递送以及相关的免疫原性等问题。另外作为RNA精准编辑工具，LEAPER不会引起基因组序列改变，在安全性方面具有优势。尽管LEAPER在科研和疾病治疗中具有可观的潜力，该技术还存在一定的局限：一是LEAPER利用的是内源编辑酶，其编辑效率会因此受限；另外，具有一定长度的arRNA可能使目标编辑位点邻近的碱基发生脱靶编辑，因此该技术亟需优化升级。

2022年2月10日，北京大学魏文胜课题组在Nature Biotechnology杂志发表的最新研究发现，通过优化表达载体中的启动子增强arRNA表达可以显著提升LEAPER系统的编辑效率，表明arRNA在细胞中的丰度对于编辑效率十分重要。然而线性arRNA在细胞内容易被降解的特点成为了制约因素。为了克服这一问题，课题组通过设计并运用可招募ADARs的环形RNA（circular ARAR-recruiting RNA, circ-arRNA），实现了编辑效率提升。

环形RNA没有5’或3’末端，可以避免核酸外切酶的切割，在细胞内相比于线性RNA具有更好的稳定性和更长的半衰期。研究发现，circ-arRNA能够维持较长时间的高水平表达。在多个内源转录本位点中，circ-arRNA平均编辑效率相比于线性版本提升了超过3倍，同时也可维持长达近半个月的有效编辑。通过腺相关病毒（AAV）递送，遗传编码的circ-arRNA可以在人的原代细胞和类器官中实现长时程的RNA编辑。另外，体外合成的circ-arRNA也可实现高效的靶向编辑，并且与遗传编码的circ-arRNA具有类似的特征。

由于ADAR蛋白的底物为双链RNA，靶向RNA与circ-arRNA形成的双链区域内的腺苷酸会有不同概率的脱氨风险。消除这种邻近碱基的脱靶编辑（bystander off-target editing）是实现更加精准的单碱基编辑的关键。进一步研究发现，当删除arRNA或circ-arRNA上非靶向腺苷酸对面的核苷酸后，可以有效避免非靶向腺苷酸的编辑。据此重新设计的circ-arRNA在内源转录本上基本消除了双链RNA区域内目标转录本上的脱靶，同时维持了较高的精准靶向编辑效率。因此，circ-arRNA不仅提升了RNA编辑效率，还消除了邻近碱基的脱靶编辑，这一升级版技术被命名为LEAPER 2.0。

接下来对LEAPER 2.0应用潜能的评估显示，circ-arRNA可以成功激活Wnt信号通路，修复TP53基因中的致病突变使其表达的p53恢复转录调节功能。使用AAV将circ-arRNA递送至Hurler综合征疾病模型小鼠体内，可以成功修复Idua致病突变并恢复IDUA的酶活。这些结果表明，LEAPER 2.0在科研和疾病治疗中具有令人期待的优势与潜能。

14、cadRNAs

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-021-01171-4

成果：RNA编辑技术有望成为治疗遗传性疾病的基因疗法。在概念验证中，加州大学圣地亚哥分校的研究人员表明，该技术可以通过纠正RNA中的致病突变来治疗Hurler综合征(一种罕见的遗传性疾病)小鼠模型。研究结果于2022年2月10日发表在Nature Biotechnology杂志上。

如前文所述，目前的RNA编辑技术利用了人体细胞中自然存在的RNA编辑酶ADARs。它们与RNA结合并将一些腺苷(A)碱基转化为肌苷(I)，后者被细胞的翻译机制解读为鸟苷(G)。此外，为了使用ADARs对RNA进行定向的A-to-I (或本质上是A-to-G)编辑，需要一段gRNAs。不过，传统的gRNAs在细胞内使用原生ADARs时效率不高，因此需要引入外源ADARs，但这又会带来递送和脱靶问题。

为了克服这些问题，在这项研究中，科学家们设计了一种新型的gRNAs，即环状ADAR招募向导RNA（circular ADAR-recruiting guide RNAs, cadRNAs），它可以非常有效地招募细胞自身的ADARs，在精确的目标RNA区域进行编辑。

该团队设计了这种特别的cadRNAs，以针对导致Hurler综合征的单一G-to-A突变。将cadRNAs系统注射到患病小鼠体内，两周后可纠正7%至17%的突变RNA。

cadRNAs之所以更有效，一方面是因为它们比传统的gRNAs更长。这使得它们对存在于细胞中的ADARs更有粘性，并与它们结合。除了“更长”，圆形的独特设计使cadRNAs比传统的gRNAs更稳定。它们可以持续数天，并在目标RNA区域停留更长的时间。环状结构使它们能够抵抗细胞的RNA降解酶。此外，科学家通过设计，使得cadRNAs只在目标RNA区域的预定位置折叠成环状结构，这让其作用更加精确（减少脱靶）。

该团队的下一步工作将集中于改善cadRNAs向细胞内的递送。一家名为Shape Therapeutics的公司正致力于这项新技术的临床转化。

15、AIMers

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01225-1

成果：2022年3月7日，美国Wave Life Sciences 公司在Nature Biotechnology 上发表文章，报道了该公司最新的临床前概念验证数据，显示其开发的作用于RNA腺苷脱氨酶（ADAR）的RNA编辑“瞄准器”——AIMers，在非人灵长类动物模型中提供了有效、持久和特定的编辑，在肝脏治疗应用方面具有更广泛潜力。

AIMers是一种化学修饰的短寡核苷酸，通过作用于ADAR，包括广泛和组成性表达的ADAR1 p110亚型，来指导内源性转录物的高效和特异性腺苷A→肌苷I（鸟苷G）的转换编辑。AIMers可在体外gymnotic条件下被几种具有高编辑效率的细胞吸收，并可与N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）结合，这是一种已经临床验证的肝脏递送载体。在编辑效率方面，AIMers能够编辑非人灵长类动物肝脏中多达50%的β-肌动蛋白的mRNA，并且在一个多月的时间内保持高达40%的编辑水平。

总结来说，AIMers无需复杂的递送载体，如病毒载体或脂质纳米颗粒，就可以在肝脏、中枢神经系统（CNS）和其他组织中实现持久的编辑。在未来的计划中，Wave公司将继续扩大AIMers在CNS和肝脏遗传病中的应用，并探索利用AIMers通过调节蛋白质相互作用来治疗非遗传疾病。

16、TALED

杂志：Cell

论文：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.03.039

成果：2022年4月25日，发表在Cell杂志上的一项研究中，来自韩国的一个科学家团队带来了碱基编辑领域的一项里程碑进展。他们开发了一种名为TALED（transcription activator-like effector-linked deaminases）的碱基编辑器，实现了线粒体基因组中A-to-G的碱基转换。TALED被认为是碱基编辑技术中缺失的最后一块拼图。

先前科学家们已经成功开发出了能够实现细胞核DNA自由碱基编辑的各类技术，以及成功实现线粒体DNA C-to-T转换的碱基编辑技术。在这篇Cell论文中，Sung-Ik Cho等科学家们终于破解了在线粒体DNA中实现A-to-G转换的难题。具体来说，他们融合三种不同的组件创造了TALED技术。第一个组成部分是一个转录激活子样效应器(TALE)，它能够靶向DNA序列。第二种成分是TadA8e，一种促进A-to-G转换的腺嘌呤脱氨酶。第三种成分DddAtox是一种胞嘧啶脱氨酶，其作用是使DNA更容易被TadA8e编辑。

“以前没有人想过使用TadA8e对线粒体进行碱基编辑，因为在先前的认知中，它只针对单链DNA。正是因为跳出了这种‘固定思维’帮助我们发明了TALED。”领导该研究的Jin-Soo Kim说道。

来源：Cell

在TALED技术中，之所以TadA8e能够对线粒体双链DNA (dsDNA)执行A-to-G的编辑，是因为DddAtox提供了至关重要的帮助。研究人员推测，在DddAtox帮助瞬时解开双链DNA的短暂时间窗口内，TadA8e快速地进行了必要的编辑。

TALED在人类细胞中非常高效，在各种线粒体基因中共17个目标位点催化A-to-G转换的编辑频率高达49%。安全性研究显示，TALED既未显示细胞毒性，也未导致线粒体DNA的不稳定性。脱靶方面，TALED未对细胞核DNA产生不想要的脱靶编辑，在线粒体DNA中也极少有脱靶效应。

在人类线粒体DNA中进行A-to-G转换，可以纠正43%（39种）已知的致病突变。接下来，研究人员的目标是提高编辑效率和特异性以进一步改善TALED，最终为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者的致病线粒体DNA突变铺平道路。（推荐阅读：陈佳点评 | Cell里程碑：碱基编辑「最后一块拼图」，新技术TALED来了）

递送技术

17、eVLP

杂志：Cell

论文：https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.12.021

成果：2022年1月11日，在Cell杂志上发表的一项研究中，Broad研究所David Liu团队开发了一种工程化无DNA病毒样颗粒（eVLP），能有效包装和递送碱基编辑器或Cas9核糖核蛋白。在小鼠体内单次注射eVLP可将降低78%的血清PCSK9蛋白水平，而且能部分恢复遗传性失明的小鼠模型的视觉功能，此外，体外和体内实验中几乎没有检测到eVLP的脱靶编辑。

来源：Cell

研究人员通过在颗粒表面使用不同的分子来优化eVLP，他们系统设计了eVLP结构的不同部分，优化了eVLP生产、货物封装、货物在胞内的释放和分配这几个关键步骤，最终生成的第四代eVLP（v4 BE-eVLP）所能包装的碱基编辑器RNP蛋白比初始报道的VLP多了16倍。

v4 BE-eVLP可在几种主要的小鼠和人类细胞类型中进行有效的碱基编辑，而且将编辑器RNP蛋白递送后，几乎没有检测到脱靶编辑。此外，eVLP不含DNA的特性避免了DNA整合到细胞基因组中的可能性。

研究者称，eVLP结合了病毒和非病毒传递系统的优势，不仅可以用于碱基编辑，还可以用于递送其它治疗性蛋白。研究团队正在拓宽eVLP靶向的器官和细胞类型范围，未来他们还将继续表征eVLP，以更好地预测和减轻颗粒可能产生的任何不需要的免疫应答。（推荐阅读：Cell突破：David Liu团队开发碱基编辑递送新工具——病毒样颗粒，可实现多器官靶向编辑）

18、C16-siRNA

杂志：Nature Biotechnology

论文：https://doi.org/10.1038/s41587-022-01334-x

成果：2022年6月2日，RNAi疗法领导者Alnylam Pharmaceuticals发表在Nature Biotechnology上的一项研究显示，通过2'-O-十六烷基 (C16) 缀合的亲脂性小干扰 RNA (siRNA)偶联物可靶向肝外组织，包括中枢神经系统、眼、肺组织，并提供了有望治疗上述组织疾病的早期临床前证据。

通过将C16与靶向SOD1的siRNA偶联后，向啮齿类动物单次鞘内给药后发现，缀合物在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中广泛分布。这种偶联物以剂量依赖的方式降低了SOD1水平，在最高剂量0.9 mg下可敲除超过75%的靶标。

为了研究这种修饰技术在非人类灵长动物中能否同样维持较强的中枢神经系统活性，研究人员将C16偶联到一种靶向淀粉样蛋白 β 前体蛋白 (APP)的siRNA中。结果表明，修饰后的siRNA分子在脊髓和大脑中分别可降低70%和80%水平的APP，作用时间超过3个月。此外，这种偶联物在大脑、脊髓等组织中具有良好的耐受性。

C16偶联还可用于眼部递送。研究表明，一种靶向转甲状腺素蛋白（TTR）的siRNA修饰后通过玻璃体腔给药，在视网膜色素上皮中成功降低了超过95%以上的靶基因；同样地，一种靶向SOD1的siRNA经C16偶联后在小鼠肺组织中广泛分布（包括细支气管和肺泡），以10 mg/kg给药在2个月内可降低57%SOD1 mRNA。（推荐阅读：靶向神经系统、眼、肺！Alnylam《自然》子刊报道新型递送系统，或开辟RNAi疗法新应用）

其他技术

19、AAV-NoSTOP

杂志：Nature

论文：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04533-3

成果：2022年3月24日，美国麻省大学Chan医学院的研究人员发表在Nature上的一篇论文报道了首次研发重组腺相关病毒（rAAV）体内递送无义突变抑制性tRNA治疗平台（AAV-NoSTOP）的研究，极大地扩展了基因治疗药物的应用策略。

无义突变，即蛋白编码序列中，有义密码子变为提前终止密码子 (premature termination codon，PTC) 的 DNA 突变，引发了大约11%的人类遗传病。抑制性 tRNA (suppressor-tRNA) 能够诱导无义突变的通读，它与天然 tRNA 的序列大部分相同，但它的反密码子（anticodon）通过碱基配对原则可以识别终止密码子（UAG, UGA, UAA) 。因此当核糖体在翻译过程中遇到 PTC 时，sup-tRNA可以引入对应的氨基酸到正在合成的肽链中，诱导通读从而获得有功能的全长蛋白。 

科学家们首次成功地利用rAAV将sup-tRNA导入体内，诱导蛋白翻译在无义突变处的通读，在黏多糖贮积症I型（mucopolysaccharidosis type I，MPS-I，Hurler综合征）UAG无义突变小鼠模型上取得了长期稳定安全的疗效。（推荐阅读：Nature：tRNA疗法，新进展来了）

20、肽设计技术

杂志：Cell

论文：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.07.019

成果：2022年9月15日，发表在Cell杂志上的一篇论文中，来自华盛顿大学蛋白质设计研究所的科学家们发现了如何制造能穿过细胞膜进入细胞的多肽。这种药物设计上的突破可能会为癌症、感染和炎症等多种疾病带来创新药物。

论文共同通讯作者David Baker教授说：“我们知道肽可以成为很好的药物，但一个大问题是它们不能进入细胞。我们的细胞内有很多很好的药物靶点，如果我们能进入那里，这个空间就会打开。”

发现如何让多肽通过细胞膜是一个化学问题。膜是由脂质组成的，大多数多肽具有的化学特征导致其可以吸附水分子，而将这些水分子拖过脂质是很困难的。在这项研究中，科学家们尝试了几种解决方案。他们首先制作了具有可以减少与水相互作用的化学特征的多肽；在另一种方法中，他们设计了可以在穿过膜时改变形状的多肽。

来源：Cell

为了评估他们新的肽设计策略，该团队合成了180多个定制多肽分子。实验室对人造膜的测试表明，大多数肽可以通过脂质。进一步涉及肠道上皮细胞的测试使科学家们相信，一些新的肽可以从胃跳到血液中。动物研究证实，当吞咽时，一些肽可以有效地离开肠道，穿过几层膜，进入活细胞。

“这种设计具有高结构精度的膜透性多肽的新能力，为结合传统小分子药物和更大蛋白质疗法的新一类药物打开了大门。”Baker教授说道。

值得一提的是，David Baker教授及其合作伙伴已经联合ARCH Venture Partners创立了一家名为Vilya的公司（2022年8月29日完成5000万美元A轮融资），该公司已经获了这篇论文描述的技术和相关分子的授权。

参考资料：[1]https://www.nature.com/articles/s41576-022-00463-y[2]https://www.sciencedaily.com/releases/2022/02/220210114026.html[3]https://www.ipd.uw.edu/2022/08/design-of-membrane-traversing-peptides-leads-to-new-spinout/[4]Science | ProteinMPNN:基于深度学习的蛋白序列设计（来源：DrugAI）[5]Nature Biotechnology | 魏文胜课题组报道升级版RNA编辑技术：LEAPER 2.0（来源：北京大学生物医学前沿创新中心）[6]Nature子刊：RNA编辑迈上新台阶！无需外源蛋白实现精准高效RNA编辑（来源：生物世界）

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